該研究通過田間試驗結(jié)合宏基因組、理化分析及結(jié)構(gòu)方程模型，系統(tǒng)解析了?“稻?–?川芎輪作”?模式降低川芎鎘積累、提升活性成分的分子與微生態(tài)機制，為道地中藥材安全優(yōu)質(zhì)種植提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐與理論依據(jù)。百邁客生物為該研究提供了宏基因組測序服務(wù)。

研究背景

川芎，作為活血行氣、祛風(fēng)止痛的經(jīng)典中藥材，在中醫(yī)臨床及現(xiàn)代中成藥制劑中應(yīng)用廣泛。然而，隨著土壤環(huán)境污染問題日益顯著，川芎中鎘元素含量超標(biāo)現(xiàn)象屢見不鮮，不僅嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量與臨床用藥安全，也制約了川芎產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。在植物降鎘領(lǐng)域，現(xiàn)有研究多集中于施用改良劑、篩選低積累品種或利用植物修復(fù)等。探尋一種既能有效阻控鎘吸收，又能兼顧藥材產(chǎn)量、品質(zhì)與種植效益的農(nóng)藝措施，成為產(chǎn)業(yè)與科研共同關(guān)注的焦點。

對此，國錦琳教授團隊率先將研究視角聚焦于川芎道地產(chǎn)區(qū)廣泛沿用的水稻-川芎輪作（Rice-Chuanxiong?rotation,?RC）模式與傳統(tǒng)種植模式的差異，深入探究這一差異化種植方式背后的生態(tài)效應(yīng)及其應(yīng)用價值。

研究結(jié)果

該研究采用多學(xué)科整合方法開展系統(tǒng)性探究：首先在四川鎘污染農(nóng)田設(shè)置?“稻?–?川芎輪作（RC）”?與?“川芎連作（CC）”?對照試驗，追蹤川芎全生育期生長指標(biāo)；隨后通過HPLC測定活性成分、ICP-MS分析鎘含量、宏基因組解析根際微生物群落；結(jié)合土壤理化性質(zhì)檢測、酶活性分析，最終利用PLS-SEM模型構(gòu)建?“微生物?–?功能?–?土壤性質(zhì)?–?鎘積累”?調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)：

• 輪作顯著提升川芎品質(zhì)與安全性，使川芎根莖鎘含量降低46%（遠低于藥典?1mg/kg?限值），活性成分藁本內(nèi)酯A含量提升44%，且不影響根莖產(chǎn)量；
• 根際微環(huán)境重塑是關(guān)鍵，輪作顯著富Geobacter、Nitrospira等7個功能屬，增強碳氮代謝等29條通路；
• 土壤理化性質(zhì)介導(dǎo)降鎘，輪作使土壤pH提升6%-16%、有機質(zhì)增加?13%-48%，通過吸附與絡(luò)合作用抑制鎘吸收；
• 調(diào)控機制明確，PLS-SEM模型證實，輪作通過招募特定微生物→強化碳氮代謝→提升土壤pH與有機質(zhì)→最終降低鎘積累，該路徑擬合度?0.6957；
• 輪作雖未降低土壤有效態(tài)鎘，但通過改變微生物功能與土壤性質(zhì)阻斷鎘向植株轉(zhuǎn)運；
• 根際微生物多樣性在收獲期顯著高于連作，且脫氫酶、蔗糖酶等關(guān)鍵酶活性提升?541%-143%，進一步佐證土壤健康改善；
• 輪作還降低了連作中富集的致病與促鎘積累微生物（如Ralstonia、Burkholderia），減少土傳病害風(fēng)險。

研究總結(jié)

該研究首次揭示了稻芎輪作（RC輪作）模式在降低川芎鎘富集方面的成效與核心機理。此模式不僅能大幅降低川芎的鎘含量，還能在保障川芎總產(chǎn)量的同時，顯著推動其有效成分的積累，達成“控鎘、增產(chǎn)、提質(zhì)”的三重目標(biāo)。研究闡明其核心優(yōu)勢機制：稻芎輪作通過重構(gòu)根際微生物群落，富集碳氮代謝相關(guān)的有益功能微生物，進而提升土壤pH值與有機質(zhì)含量，觸發(fā)了“根際微生物→微生物功能→土壤性質(zhì)→植物鎘積累”的級聯(lián)調(diào)控效應(yīng)，從源頭阻斷了鎘元素向川芎植株的遷移與富集。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，稻芎輪作模式無需額外投入化學(xué)材料、不產(chǎn)生環(huán)境副作用、易于在產(chǎn)區(qū)集成推廣，是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟可行且效益顯著的生態(tài)農(nóng)藝解決方案。該研究成果的發(fā)表，標(biāo)志著在解決中藥材重金屬超標(biāo)問題上取得了重要進展，為川芎乃至其他根莖類中藥材的綠色、安全、規(guī)范化生產(chǎn)提供了堅實的科學(xué)依據(jù)和極具前景的實踐模式，對保障中藥材質(zhì)量安全、促進產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、保護耕地生態(tài)具有重要現(xiàn)實意義。

以上內(nèi)容來源于成都中醫(yī)藥大學(xué)，侵刪

近日，北京大學(xué)李毅研究團隊聯(lián)合福建農(nóng)林大學(xué)等多個實驗室在Nature上發(fā)表了題為“Perception?of?viral?infections?and?initiation?of?antiviral?defence?in?rice”的研究論文，揭示了水稻感知病毒侵染并啟動抗病毒免疫反應(yīng)的分子機制。百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)！

研究背景

水稻作為全球半數(shù)以上人口的主糧作物，其產(chǎn)量穩(wěn)定性對糧食安全至關(guān)重要。在過去的20多年里，科學(xué)家在鑒定新病毒、解析病毒致病機理和植物抗病毒機制等方面取得了一系列的重要進展，但在植物細胞尤其是禾本科植物細胞如何感知病毒侵染進而啟動抗病毒免疫等方面還了解的十分有限。

主要成果

研究發(fā)現(xiàn)水稻RING1-IBR-RING2類型的泛素連接酶RBRL不僅能夠識別水稻條紋病毒（Rice?stripe?virus，RSV）的外殼蛋白（CP），還能識別水稻矮縮病毒（Rice?dwarf?virus，RDV）的外殼蛋白P2。進一步研究表明，RSV?CP不僅能誘導(dǎo)RBRL表達量上調(diào)，還能激活RBRL的泛素連接酶活性，進而促進RBRL介導(dǎo)的茉莉酸信號通路抑制因子NOVEL?INTERACTOR?OF?JAZ?3（NINJA3）的泛素化和降解，從而激活水稻茉莉酸信號通路。

水稻抗病毒防御反應(yīng)的分子機制

這可以理解為，當(dāng)病毒來犯時，RBRL蛋白迅速“變身”把茉莉酸信號通路抑制因子NINJA3蛋白“拿下”，從而讓茉莉酸信號通路“火力全開”，增強水稻的抗病毒能力。

李毅團隊這次的發(fā)現(xiàn)結(jié)合團隊前期研究成果，在水稻中發(fā)現(xiàn)和解析了一條核心的抗病毒通路，即從水稻細胞感知和識別病毒侵染到激活水稻抗病毒免疫機制全鏈條解析。即以水稻為模式，發(fā)現(xiàn)了從RBRL介導(dǎo)對病毒外殼蛋白感知和識別（Nature,?2025）、茉莉酸信號通路（JA）抑制子降解（Nature,?2025）、到茉莉酸信號通路激活RNA沉默核心蛋白（AGO18）表達（Cell?Host?&?Microbe,?2020）以及AGO18介導(dǎo)的RNAi和ROS協(xié)同防御的完整抗病毒免疫通路（Molecualr?Plant,?2019;?Nature?Plants,?2017;?eLife,?2015;?PLoS?Pathogens,?2011）。

研究總結(jié)

該研究為水稻抗病毒育種提供了多靶點策略：
1）利用RBRL廣譜識別特性開發(fā)廣譜抗病毒種質(zhì)；
2）通過精細調(diào)控JA信號通路增強基礎(chǔ)抗性；
3）協(xié)同優(yōu)化RNAi與ROS防御系統(tǒng)。

這一系統(tǒng)性成果將為作物抗病毒研究和育種提供新的理論框架和技術(shù)路徑。李毅團隊介紹，通過優(yōu)化RBRL蛋白功能、增強茉莉酸信號通路活性，以及強化RNA干擾（RNAi）與活性氧（ROS）協(xié)同防御能力等多種技術(shù)路徑，未來有望培育出更具抗病能力的水稻新品種，從而降低病毒病害帶來的農(nóng)業(yè)損失，提高糧食生產(chǎn)穩(wěn)定性。同時，這一研究為全球水稻生產(chǎn)提供了新的抗病毒策略，助力可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展。

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中文題目：利用Pacbio Iso-Seq測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)水稻非生物脅迫下的新轉(zhuǎn)錄本和新基因

發(fā)表期刊：International Journal of Molecular Sciences

發(fā)表時間：2020年10月31日

影響因子：4.556

研究背景

全球氣候變化導(dǎo)致高溫、干旱和夜間高溫等非生物脅迫條件的嚴(yán)重程度和頻率增加，這些都造成了作物產(chǎn)量的降低。隨著世界人口的增長，植物育種專家面臨著開發(fā)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、減少環(huán)境污染的新品種的艱巨任務(wù)。水稻是世界上一半以上人口的主要卡路里來源，特別是對亞洲最貧窮的人來說。世界各地的基因庫中保存著23萬多份水稻及其野生近緣種的廣泛自然遺傳多樣性的種質(zhì)資源，是一種無價的可用于作物改良的重要基因庫。

雖然世界上近80%的水稻種植是基于indica（秈稻亞種）品種，但目前的標(biāo)準(zhǔn)基因組及其注釋來自粳稻亞種Nipponbare。由于缺乏適當(dāng)?shù)幕蚪M，不同水稻亞種的研究大多都基于Nipponbare基因組。例如，在3000水稻基因組計劃中將測序序列比對到Nipponbare基因組上，丟棄了不能比對到該參考基因組的序列。這可能會導(dǎo)致非粳稻亞種特有的遺傳信息的丟失。另外，最近已經(jīng)對其它水稻亞種的栽培品種的基因組進行了測序，例如indica（Shuhui498，Zhenshan 97, Minghui 63）、aus（Kasalath，N22），但其完整性和注釋程度仍存在差異。值得注意的是aus亞種是抗病、耐磷酸鹽缺失、耐澇、耐厭氧發(fā)育和抗旱等潛在性狀的寶貴基因來源。例如，在aus品種基因組中發(fā)現(xiàn)了耐磷酸鹽缺失相關(guān)基因OsPSTOL1、耐澇相關(guān)基因OsSNORKEL1/2和OsSUB1A。值得注意的是，這些基因在粳稻的Nipponbare亞種基因組序列中是不存在的。

在過去的幾年里，RNA測序（特別是基于illumina的短序列RNA-seq）已經(jīng)成為分析轉(zhuǎn)錄組的有力工具，用來識別在非脅迫控制和各種環(huán)境脅迫條件下差異表達的基因。然而，需要基于參考基因組或轉(zhuǎn)錄組序列對RNA-seq數(shù)據(jù)進行比對和注釋來確定轉(zhuǎn)錄水平。在水稻中，參考基因組決定了可以鑒別的差異表達基因和轉(zhuǎn)錄本亞型。顯然，參考基因組/轉(zhuǎn)錄組中沒有的基因的表達信息在分析過程中會丟失。這在研究耐脅迫的外來品種、陸地品種或野生稻種時尤其相關(guān)，因為它們可能含有參考品種Nipponbare不存在的耐受基因。這將嚴(yán)重限制識別支持作物改良計劃的新候選基因的可能性。
解決這一問題的一個顯而易見的辦法是對所需的基因組進行測序、組裝和注釋。但是，這種方法比較昂貴和耗時。在這篇文章里，我們探索了一種更有針對性的RNA-Seq序列方法來測序和重建了三個不同亞種的水稻品種的部分轉(zhuǎn)錄本作為參考，Pacific Bioscience（PacBio）屬于提供高通量全長轉(zhuǎn)錄本序列的新一代測序方法。該方法已成功應(yīng)用于對現(xiàn)有植物轉(zhuǎn)錄本及注釋的探索和擴展，如高粱、小麥、甘蔗、野生棉花、不同的穗型草、苜蓿等。

取樣材料

樣品取自三個水稻品種的10個不同亞種的不同組織部位（表1）：

分析結(jié)果

1.重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本

使用PacBio Sequel I測序平臺對每個品種進行SMRT測序，得到15.49~24.51GB的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。用IsoSeq3軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行ccs和lima處理，每個品種SMRT cell分別得到460340~736747條全長非嵌合序列（full-length non-chimeric reads簡稱FLNC，包含3 ‘ 引物、5 ‘ 引物以及polyA尾）。全長非嵌合經(jīng)過IsoSeq3聚類和polish分別得到37951~54684高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本（HQ）以及1233 ~2170低質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本（LQ）。先將HQ與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫進行blastn比對（E<=1e-10），再將上一步為比對上的轉(zhuǎn)錄本序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進行blastx比對（E<=1e-10），去除未比對上兩個數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄本序列，最終得到37535~54594條HQ用于后續(xù)分析（表2）。

Pacbio RSII平臺聲明使用RNA-seq二代測序數(shù)據(jù)對轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進行矯正，可以得到更多的HQ序列，因為LQ序列中含有大量的插入和缺失。然而與RSII相比，PacBio Sequel I測序平臺的測序結(jié)果更好。為了驗證這一結(jié)果，我們用minimap2將未矯正的HQ比對到相應(yīng)亞種的基因組，結(jié)果表明缺失的比例很小，所以進一步的分析中沒有包含LQ序列。

2.轉(zhuǎn)錄本去冗余

在文庫準(zhǔn)備過程中，會產(chǎn)生5 ‘ RNA降解產(chǎn)物，并進行測序。這些降解產(chǎn)物具有相同的外顯子結(jié)構(gòu)，但缺乏5 ‘序列信息，因此產(chǎn)生與技術(shù)偏差或生物學(xué)背景無關(guān)的冗余異構(gòu)體。我們測試了三種不同的去冗余方法，包括cogent、cDNA cupcake和TAMA，其中cDNA cupcake和TAMA需要基于參考基因組，而cogent不需要基于參考基因組。cogent基于pacbio全長轉(zhuǎn)錄本序列重構(gòu)一個參考基因組，然后將相同的序列比對到重建的基因組，基于比對結(jié)果利用cDNA cupcake算法對轉(zhuǎn)錄本去冗余。cDNA cupcake和TAMA直接用minimap2軟件和各自的亞種參考基因組進行比對。基于這三種方法，只有很少的轉(zhuǎn)錄本不能回比到基因組上（表3）?？偟膩碚f，這三種去冗余方法均能顯著減少異構(gòu)體的數(shù)量，分別為47.6% （cDNA cupcake，Nipponbare）和68.3%（cogent，Dular）。

基于植物中430個高度保守的同源蛋白利用BUSCO軟件對TAMA算法去冗余前后的HQ進行完整性評估（圖一），由于取樣不完全，缺失了54%~27%的重要蛋白，其中Nipponbare參考基因組（IRGSP）只缺失了6種。cDNA cupcake和TAMA的結(jié)果相似，而對于cogent，超過50%的蛋白缺失，最有可能的原因是轉(zhuǎn)錄本沒有回比到重建的基因組。

去冗余后轉(zhuǎn)錄本長度中值都有所增長，長度分布和轉(zhuǎn)錄本長度中值與Nipponbare參考基因組相似。統(tǒng)計了去冗余后10個品種每個基因相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，其中基因只有一個轉(zhuǎn)錄本的比例，TAMA最高達到了75%，cDNA cupcake在60%左右，cogent只有50%。同時計算了Nipponbare參考基因組每個基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量進行比較，該參考基因中基因只有一個轉(zhuǎn)錄本的比例達到了85%（圖2）。

來自同一亞種的不同品種親緣關(guān)系更近，我們使用系統(tǒng)發(fā)育樹評估亞種之間的遺傳距離。利用去冗余后的轉(zhuǎn)錄本序列基于Nipponbare參考基因組識別SNPs，使用SNPhylo繪制進化樹（圖3）。SNPhylo提取高質(zhì)量并且具有代表性的SNPs進行后續(xù)分析，cDNA cupcake算法大約30000個SNPs，cogent算法大約23200個SNPs，TAMA算法大約16000個SNPs。三種方法中，同一亞種的不同品種聚類在了一起，cDNA cupcake算法和cogent的聚類結(jié)果更相似。三種方法均能將aus與另外兩個亞種區(qū)分開，但cogent和TAMA對indica和japonica種間的區(qū)分不如cDNA cupcake明顯。

3.評估重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本

基于TAMA算法得到的HQ進行轉(zhuǎn)錄本的評估。由于TAMA只對比對到參考基因組上的轉(zhuǎn)錄本進行去冗余，我們用cogent對沒比對上參考基因組的轉(zhuǎn)錄本進行去冗余。合并結(jié)果后，每個品種最終得到10511（Dular）~15011（IR64）個基因，14255（Dular）~20803（Moroberekan）個轉(zhuǎn)錄本（表4）。與Nipponbare參考基因組相比，大約三分之一的基因位點和大約一半的轉(zhuǎn)錄模型被重建。每個品種每個基因的平均轉(zhuǎn)錄數(shù)約為1.4～1.5，略高于參考基因組的1.2。中位轉(zhuǎn)錄本長度為986 bp（Dular）~1394 bp（Nipponbare），與Nipponbare參考值1385 bp相似。平均GC含量在50.87%（Dular）~52.76%（IR64），與Nipponbare參考值51.24%相似。利用gffcompare軟件與Nipponbare參考基因組進行比較識別新基因與轉(zhuǎn)錄本。

4.功能注釋

為了深入了解重建轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)信息，我們進行了功能注釋。使用TransDecoder軟件預(yù)測開放閱讀框（ORFs），包括blast和PFAM，結(jié)果表明大約有60%~70%的完整ORFs（包括啟動和終止密碼子）。此外還發(fā)現(xiàn)了26%~38%的5 ‘ ORF、很少比例的3 ‘ ORF和中間ORF（既沒有起始密碼子也沒有終止密碼子）（圖4）。

使用Trinotate和Mercator4進行功能注釋。Mercator4是專門為植物開發(fā)的，它使用了一種簡單的層次樹結(jié)構(gòu)，被稱為“容器”，用來描述生物學(xué)概念。主要的生物過程如光合作用，都是由頂層的容器來表示的，每個子容器描述的是一個更詳細的子過程。目前本體包括27個功能類別，代表了植物中不同的生物過程。N22、IR64和Nipponbare三個品種作為各自亞種的代表與植物中所有水稻基因的分類進行比較分析，結(jié)果顯示三個品種的注釋結(jié)果分布相似（圖5）。超過28000個水稻已知基因在Mercator庫中沒有注釋分類信息，因此三個品種有8000~10000個轉(zhuǎn)錄本沒有分類注釋到Mercator庫。

5.品種間共有和特有的轉(zhuǎn)錄本

為了鑒定品種特異性轉(zhuǎn)錄本，以N22、IR64和Nipponbare三個品種的轉(zhuǎn)錄本作為blast比對庫，其它9個品種與其進行比對（圖6）。識別到N22特有轉(zhuǎn)錄本652個，IR64特有轉(zhuǎn)錄本2426個，Nipponbare特有轉(zhuǎn)錄本349個。

6.aus特有轉(zhuǎn)錄本的差異表達分析

aus品種N22特別抗旱和耐熱脅迫，因此我們想知道在這些條件下是否有aus特異轉(zhuǎn)錄本受到調(diào)控。以N22為研究對象，分析干旱和熱脅迫下差異表達的基因。利用從發(fā)育種子中分離的RNA進行Illumina測序，將測序數(shù)據(jù)回比到重構(gòu)的N22轉(zhuǎn)錄本。使用DESeq2基于參數(shù)FDR<0.1和|log2FC|>=1軟件識別出56個aus特異的差異表達基因。這56個差異基因進行blast比對，其中46%比對上擬南芥，27%沒有任何注釋信息，11%僅描述了一個PFAM域或與其它植物物種的序列同源，而在水稻中僅有5%已知同源基因。

舉個例子，在高溫和干旱雙重脅迫下顯著上調(diào)的基因B12288。它在japonica和indica中均有同源基因RAB21，這個基因受干旱的誘導(dǎo)，其編碼的蛋白屬于LEA脫氫蛋白家族。與水稻其它脫氫蛋白進行多序列比對研究（圖7），N22實際上的基因與野生稻、O. sativa ssp. japonica中其它4種脫氫酶的親緣關(guān)系密切。序列覆蓋率為89.5%，序列同源性86.0%，其中包含脫氫酶高度保守的重復(fù)區(qū)。相比japonica蛋白，N22蛋白序列與野生稻更接近。

總結(jié)
本文主要探討了Pacbio Iso-Seq獲得的轉(zhuǎn)錄本相比于Nipponbare參考基因組是否可以用于aus等水稻亞種的下游分析。此外通過這些轉(zhuǎn)錄本，我們希望發(fā)現(xiàn)水稻非生物脅迫下新的轉(zhuǎn)錄本和基因。我們的分析表明所有品種都可以鑒定出特異的轉(zhuǎn)錄本，還確定了aus亞種特異的差異表達基因。Pacbio Iso-Seq這種方法適用于其它沒有基因組或者基因組質(zhì)量不高的物種，相比對基因組組裝，這種方法更省時便宜。

研究背景

水稻是最重要的糧食作物之一，在過去的50年里，通過雜交育種已經(jīng)大幅度提高了水稻的產(chǎn)量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸，多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優(yōu)勢基因發(fā)生重組和相互作用的可能性，提高水稻對環(huán)境的適應(yīng)能力。

同源四倍體水稻（autotetraploid rice）是二倍體水稻經(jīng)過染色體加倍形成的新種質(zhì)。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強大的生物學(xué)優(yōu)勢，蘊含著巨大的增產(chǎn)潛力，可望成為未來水稻育種的新途徑。然而，其雜種F1普遍存在育性偏低，產(chǎn)量優(yōu)勢難以發(fā)揮，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上難以直接應(yīng)用的問題。所以，如何創(chuàng)制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體（neo-tetraploid）是利用其優(yōu)勢的關(guān)鍵。

為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問題，華南農(nóng)大某研究組經(jīng)過20年的努力，培育出2個新型四倍體水稻，其結(jié)實率可達80%以上，于2016年獲得國家植物新品種權(quán)。本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組測序，研究新型四倍體（Huaduo 3）與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達情況，為解析新型四倍體育性和雜種優(yōu)勢的分子機制打下基礎(chǔ)。

材料方法

新型四倍體水稻Huaduo 3（H3），40種不同的同源四倍體水稻，以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x（T452）與H3的雜交F1代用于測序分析。
轉(zhuǎn)錄組測序：取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉。每個組織每種品系有3個生物學(xué)重復(fù)，共27個樣品。測序平臺為Illumina HiSeq 2500，平均每個樣品測約5G。
小RNA測序：取T452，H3及雜交F1代的減數(shù)分裂階段的花藥進行小RNA測序，無生物學(xué)重復(fù)。
全基因組重測序：兩個親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測序。
嗯，測序手段還是挺多滴！

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.新型四倍體水稻Huaduo 3（H3）的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過程
將兩種同源四倍體水稻（Jackson-4x和96025）進行雜交，獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進行連續(xù)自交，到F5代時發(fā)現(xiàn)一株水稻有80%的結(jié)實率，這株水稻經(jīng)過多代連續(xù)自交，到F10-F13代時出現(xiàn)可以穩(wěn)定遺傳的高結(jié)實率性狀，這個品系被命名為Huaduo 3（H3）。H3不僅結(jié)實率高，還有其它高產(chǎn)性狀（表1），其花粉母細胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻（26個印度種和14個日本種）進行雜交，獲得的40種F1代表現(xiàn)出了很多大大優(yōu)于親本的性狀，尤其是單株谷粒數(shù)、結(jié)實率、單株產(chǎn)量等性狀。為了進一步研究雜交F1代的雜種優(yōu)勢，我們挑選了T452和H3的雜交F1代進行轉(zhuǎn)錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體，雜交F1代的高親優(yōu)勢幾乎都是正的，除了谷粒長度和10谷粒寬度兩個指標(biāo)。雜交F1代的中親優(yōu)勢除了10谷粒寬度這一個指標(biāo)以外都是正的，說明雜交F1代表現(xiàn)出了明顯的雜種優(yōu)勢。
高親優(yōu)勢（High-parent heterosis，HPH）是指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與高值親本（HP）同一性狀數(shù)值差值的比率。高親優(yōu)勢（%）=(F1-HP)/HP*100%。
中親優(yōu)勢（Mid-parent heterosis，MPH）指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與雙親（P1和P2）同一性狀的平均值差值的比率。中親優(yōu)勢（%）=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。

表一：T452與H3雜交F1代的雜種優(yōu)勢。HPH：高親優(yōu)勢；MPH中親優(yōu)勢；PH：植株高度；EP：單株谷粒數(shù)；FG：單花谷粒數(shù)；SS：結(jié)實率；GYP：單株產(chǎn)量；GL：10谷粒長度；GW：10谷粒寬度。

圖1：親本和雜交F1代的表型。（A）Jackson-4x（T45），Huaduo 3（H3）與96025（T44）的谷粒大小，H3是來自T45和T44的雜交；（B）H3在大田中的長勢；（C）T45，H3，T44的植物表型；（D）Shennong15-4x（T424），H3，以及兩者雜交F1代的表型。

2.轉(zhuǎn)錄組測序
因為T452和H3的雜交F1代表現(xiàn)出了優(yōu)良性狀，因此可以通過轉(zhuǎn)錄組測序研究性狀差異的原因。取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉。總共測了548M clean reads，平均有89.06%的reads可以比對到參考基因組上，其中93.45%都是比對到唯一位置上。三個生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性都達到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對12個差異表達基因（DEG）的表達量進行了驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。對不同樣品進行層次聚類分析表明，相同組織的樣品總能聚到一塊（圖2）。

圖2：所有基因的層次聚類分析。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

3.差異表達基因（DEG）分析及注釋
在三個不同株系中共發(fā)現(xiàn)17877個DEG，兩兩比較的DEG數(shù)目在1521到2498之間（表2）。F1和親本之間的DEG稱為DEGF，親本之間的DEG稱為DEGP。DEGF的基因能分為兩個不同的組，其中一個組在DEGP里面也有，另一個組只屬于DEGF，后者被稱為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異，因此接下來的研究種重點關(guān)注DEGFu基因。在這17877個DEG里面，有1150，1014，1122個DEGFu與花藥、子房、葉片有關(guān)，其中分別有807，663，866個基因與花藥、子房、葉片特異相關(guān)，這些基因被稱為DEGFu-sp。

表2：三個不同組織中的差異表達基因統(tǒng)計。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

為了研究DEGFu-sp基因的功能，我們首先研究了其中的轉(zhuǎn)錄因子，共發(fā)現(xiàn)了44個轉(zhuǎn)錄因子，花藥里面16個，子房里面10個，葉片里面18個。對DEGFu-sp基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明這些基因相互之間有顯著的聯(lián)系，多個代謝通路富集程度較高。

GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個生物學(xué)過程類別顯著富集，包括光合作用、代謝途徑、合成調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。6個通路類別顯著富集，包括光合作用和代謝通路。13個基因在F1中的表達量顯著高于T452。在807個花藥特異的DEGFu-sp中，15個基因與46個其它重要基因共表達。

接下來用同樣的方法對子房和葉片中的DEGFu-sp基因進行了GO富集分析。在葉片當(dāng)中有5個基因在F1中表達量顯著高于T452。H3水稻葉片在開花過程中顏色逐漸變化，而T452葉片在開花過程中顏色保持不變。因此，我們比較了葉片中F1比T452上調(diào)的基因，以及H3比T452上調(diào)的基因，兩者有74.01%的重合。有趣的是，在葉片中發(fā)現(xiàn)了兩個主要的功能基因類別，分別是程序性細胞死亡和防御反應(yīng)。

4. 花藥特異性差異表達基因與減數(shù)分裂有關(guān)

因為T452育性較低，而F1代育性較高，為了研究育性的差異，我們重點研究了F1花藥中與T452相比上調(diào)的基因。首先，有643個基因在F1花藥中與T452相比特異上調(diào)，這其中排除了H3與T452相比上調(diào)的基因。對這643個基因進行GO分析表明，有6個功能基因類別富集，這些基因與防御反應(yīng)、光合作用、細胞凋亡和程序性細胞死亡有關(guān)。這其中有41個基因在育性較低的同源四倍體中表達量低于二倍體。在這41個基因中，4個基因，LOC_Os04g33830，LOC_Os12g08770，LOC_Os06g21590，LOC_Os07g25430，與光合作用有關(guān)。

接下來，將這643個特異上調(diào)的基因與野生型水稻花藥減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達量相互比較，發(fā)現(xiàn)有9個基因都在減數(shù)分裂前期到四分體期表達。

隨后，我們比較了花藥特異性差異表達基因DEGFu-sp和野生型水稻減數(shù)分裂相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)有42個減數(shù)分裂特異性基因和8個減數(shù)分裂相關(guān)基因（圖3）。在8個減數(shù)分裂相關(guān)的基因中，有兩個基因和DNA修復(fù)和染色體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

因為轉(zhuǎn)錄組也會被表觀遺傳調(diào)控，我們也進了小RNA測序。在花藥中發(fā)現(xiàn)了288個差異表達的miRNA（DER），其中有13個為新發(fā)現(xiàn)的。在這288個DER中，有38個只在F1與親本相比中特有，這38個基因被稱為DERFu。這38個DERFu有397個靶標(biāo)基因。GO分析表明這397個靶標(biāo)基因有7個功能基因類別富集，這些基因與細胞凋亡、防御反應(yīng)、程序性細胞死亡、細胞自噬、DNA完整性和脅迫反應(yīng)有關(guān)。而且，大部分靶標(biāo)基因同于F1或者H3中上調(diào)的基因。然后我們比較了這38個DERFu與之前發(fā)現(xiàn)的差異表達miRNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中一個miRNA，osa-miR5072_L-2_1ss3AG，在

Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調(diào)。這個miRNA靶標(biāo)基因為 LOC_Os02g24960，是一個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因。

圖3：與育性和雜種優(yōu)勢相關(guān)的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因，藍色為花藥中的基因，黑色為子房中的基因。

表3：花藥中的差異表達miRNA（DER）列表

5.雜交F1代非累加基因表達
F1代表達的基因可以分成兩個類別，一類是累加基因，一類是非累加基因。累加基因的表達量來自兩個親本的等位基因之和，非累加基因的表達量由兩個親本等位基因的平均值決定。在三個組織中共發(fā)現(xiàn)了1224個非累加基因（NDEG），在花藥、子房和葉片中分別為314個，578個，332個。其中895個上調(diào)，329個下調(diào)。通過對花藥NDEG和水稻花藥減數(shù)分裂特異性基因表達數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)了53個共有的基因。其中有7個基因在四倍體中表達量低于二倍體水稻。

表4：非累加表達基因（NDEG）和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數(shù)量統(tǒng)計。星號表示NDEG在F1表達的總基因中的比例。

6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達基因之間的關(guān)系
DNA重測序表明T452和H3有很多序列差異，兩者共有2351039個SNP，其中1192412個SNP在T452中特異存在，374460個SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個Indel，其中248194個Indel在T452中特異存在，84196個Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比，SNP和Indel多態(tài)性分別為66.77%和69.97%。在這些多態(tài)性位點中，約65%的SNP和72%的Indel在基因區(qū)。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達基因的調(diào)控區(qū)域。另外，有58908個SNP和5561個Indel位于基因編碼區(qū)。
因為T452和H3存在大量的DNA序列差異，我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異，結(jié)果表明花藥、子房和葉片中分別有330個、291個、459個基因存在DNA序列差異（SNP或Indel）。花藥相關(guān)的330個基因可以分為15個不同的生物學(xué)過程類別，主要和光合作用、細胞代謝、轉(zhuǎn)錄和生物合成有關(guān)。子房相關(guān)的基因有1個生物學(xué)過程富集，即代謝通路。同樣的，葉片相關(guān)的基因有8個生物學(xué)過程富集，包括氮代謝、細胞運輸?shù)?。這些富集的生物學(xué)過程基本上與DEGFu-sp富集的生物學(xué)過程一致。
另外，非累加差異表達基因中也有SNP和Indel，花藥、子房和葉片中分別有67個、133個、87個基因存在DNA序列差異，并對這些基因進行了富集分析。其中25個基因為轉(zhuǎn)錄因子。

結(jié)論

本研究培育了一個新型四倍體水稻H3，H3與同源四倍體T452雜交產(chǎn)生的F1代具有育性高、產(chǎn)量高等優(yōu)良的雜種優(yōu)勢性狀。通過比較H3，T452，以及雜交F1代的三個不同組織（花藥、子房、葉片）的轉(zhuǎn)錄組差異，尤其是重點分析了花藥的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了多個與減數(shù)分裂有關(guān)的差異表達基因，這些基因可能與雜種優(yōu)勢有關(guān)。對花藥的小RNA測序也找到了一些F1中差異表達的miRNA，這些miRNA的靶基因也與轉(zhuǎn)錄組測序中上調(diào)的基因有大部分重合，說明miRNA可能參與調(diào)控了雜交F1代的性狀差異。對兩個親本DNA序列的差異進行全基因組重測序分析，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。

創(chuàng)新點

培育出高結(jié)實率的新型四倍體水稻，可以用于四倍體水稻育種；
轉(zhuǎn)錄組測序比較了新型四倍體水稻，同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因；
小RNA測序和全基因組重測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，深入解析性狀差異原因。

點評

這篇文章選取的實驗材料很好，性狀優(yōu)良，而且研究得很深入，比較了三種水稻三個不同組織的轉(zhuǎn)錄組，還進行了小RNA測序和全基因組重測序。通過深入分析，找到了一些影響水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因，為后續(xù)的育種工作打下了基礎(chǔ)。
對多種測序手段結(jié)合分析感興趣的小伙伴快來試試吧！

參考文獻

Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.